陈锦飞、崔笑雯、韦敬荪、陈玥彤、黄缓缓等译
由美国病理学家协会、国际肺癌研究协会和分子病理学协会共同发布的《选择靶向酪氨酸激酶抑制剂治疗肺癌患者的分子检测指南》进行了更新，医院（南京医院）肿瘤科陈锦飞教授团队对本次指南更新进行了翻译，供各位医生参考与讨论！
在回顾年以来发表的文献之后，原先的建议大部分得到重申。随着补充证据的公布，有几项声明得到了强有力的重申(SDC表4a,4b和5)。有些人要求在本次修订中重新进行完整的评价，随后将出现（表3）；这些包括使用IHC的ALK，NGS多基因检测的使用，以及检测非腺癌样本的问题。在余下的年建议中，有以下变化：
1．任何有足够细胞和保存的细胞学样品都可以检测。
原来推荐的细胞块优于涂片。最近文献检索确定的系统评价表明，已经发表的大量的研究表明涂抹制剂的好处，使得这种优点不再突出。任何检测细胞病理学标本的实验室都有责任对这些样本进行恰当的验证研究，作为不同于组织和血液样本的单独样本类型。
2.分析方法必须能够检测具有20％及以上恶性细胞含量的样品中的突变
虽然表明EGFR突变肺癌对用EGFR抑制剂治疗的反应的原始研究使用未修饰的Sanger测序，灵敏度极限为50％肿瘤细胞性，但这在实践中是不够的，因为许多肺癌样品很小并且包含大部分良性基质细胞，大多数确认EGFR突变检测的临床实用性的较大的III期临床试验使用基于聚合酶链式反应（PCR）的方法，其比未修饰的Sanger测序更敏感。考虑到能够可靠地检测小样本中低频突变事件技术的广泛可用性，所以不再提供低灵敏度的检测，其不能检测具有20%至50%肿瘤含量的肿瘤，并且需要患者接受更多的检查以及潜在的更具侵入性的检查，而这种检查仅用于获取具有高肿瘤含量的组织样本。
3.免疫组化不适用于EGFR突变检测
对于EGFR激酶抑制剂，免疫组化对总EGFR蛋白没有决定作用。靶向突变导致该跨膜蛋白胞浆激酶的活化，但这与细胞表面的表达程度无关，这是由总EGFR免疫染色检测到的。尽管本世纪初对EGFR激酶抑制剂的一些早期研究通过免疫组化观察EGFR的表达，但在具有突变但免疫组化缺乏或弱表达的患者中观察到临床反应，并且在免疫组化强阳性的患者中观察到不良反应但没有观察到突变。发现EGFR突变后，针对最常见的突变形式（最显著的是LR替代和至ELREA缺失）的蛋白质，开发了用于免疫组织化学的抗体。原始指南允许通过免疫组织化学在仅有非常有限材料的条件中使用突变特异性EGFR抗体。尽管这些抗体的公开证据显示这些抗体对LR激活突变和一些外显子19缺失具有良好的精准度，但对其他外显子19缺失的敏感性较差，对不太常见的突变（例如密码子突变）不敏感，对外显子20插入会出现假阳性结果。总体而言，这种检查对可靠检测EGFR突变是次选。鉴于分子诊断技术的进步，现在能够对非常有限的样本以及循环的肿瘤DNA进行分析（见下文），此时，在选择肺癌患者抗EGFR治疗中，常规使用突变特异性免疫组化没有任何作用。
表3：以建议强度为基础的最新声明摘要
新建议
问题1：肺癌患者应该测试哪些新基因？
年指南中基因分为两类：检测是必要的（EGFR，ALK）或检测是研究性的。一个基因，KRAS，由于其易于分析和与EGFR和ALK相互排斥，在连续检测算法的背景下，被认为是必需的。但是到年，我们认为现在应该分为三类基因。第一类基因是所有检测肺癌的实验室都必须提供作为最基础检查的：EGFR，ALK和ROS1。如果有足够的可供选择的材料，那么为肺癌患者提供的第二类基因应应该包括BRAF，MET，RET，ERBB2（HER2）和KRAS。KRAS检测也可作为单基因检测来排除患者扩大的检测。出版的时候，其他所有基因都被认作是研究性的。
在这种情况下，为肺癌患者提供护理的机构有一个选择：（1）提供全面的癌症检测，其中包括前2类的所有基因适用于所有合适患者的类别（EGFR，ALK，ROS1，BRAF，MET，ERBB2[HER2]，KRAS，RET）；或（2）为所有适当的患者提供必需测试类别（EGFR，ALK，ROS1）中的基因的靶向测试，并作为第二检测提供包含第二类基因（BRAF，MET，ERBB2[HER2]和RET）适用于适合临床试验的患者，可能是在进行单基因KRAS检测后，将KRAS突变型癌症患者从扩大的检测试验中排除。表4包括推荐的列表，具有较强的推荐度。
1.强有力的建议
无论临床特征如何，必须对所有晚期肺腺癌患者进行ROS1检测。有令人信服的有力证据支持使用ROS1分子（即逆转录PCR[RT-PCR]或测序）或细胞遗传学（即FISH或其他原位杂交）检测来鉴定ROS1重排。支持使用任何临床特征来识别应该接受ROS1测试的患者的证据是足够的。这项建议基于证据，并得到9项研究的支持，其中6项研究报告了ROS1重排与患者或肿瘤特征之间的关联，并包括1项前瞻性队列研究。其余3项研究评估了用ROS1靶向治疗克唑替尼治疗的患者的临床结果，并包括1项非随机临床试验和3项RCS。所有纳入的研究都进行了质量评估，没有发现方法缺陷会引起对研究结果的担忧（SDC表6）。请参阅SDC表7以获取支持使用ROS1分子或细胞遗传学检测的研究结果总结，以便选择患者进行ROS1靶向治疗。
尽管相对较少，占非小细胞肺癌的2％以及肺腺癌的2％～3％，涉及ROS1基因的结构重排产生可用靶向抑制剂成功治疗的致癌融合物。50例非小细胞肺癌患者的一项单独I期临床试验表明，通过FISH或RT-PCR检测ROS1重排的存在预示了使用克唑替尼对靶向抑制的反应，反应率为72％，中位无进展生存期为19.2个月。根据这项试验，FDA批准年扩大使用克唑替尼治疗ROS1重排型非小细胞肺癌患者。一项欧洲多机构回顾性研究32例使用克唑替尼治疗的ROS1重排型非小细胞肺癌患者，其反应率为80％，无进展生存期为9.1个月。无论是否靶向治疗，ROS1重排肿瘤患者的总体存活时间长于靶向治疗的其他分子改变患者。与ALK一样，ROS1激活由结构变体驱动，多种不同的配偶体融合到含有细胞质酪氨酸激酶的ROS1的C端部分，并通过MAPK，JAK/STAT和PI3K途径驱动下游信号传导。常见的融合伴侣包括SLC34A2，CD74和TPM3等。野生型ROS1的作用仍在阐释中，它与ALK具有类似的结构，尽管有显著差异，特别是缺少二聚化结构域，与细胞粘附分子具有某些相似性的细胞外结构域，并且没有明确的配体。
随着EGFR突变和ALK重排，轻至无吸烟史与肺腺癌患者ROS1重排的发生率相关。然而这种关联在整个研究中一直没有被一致地观察到。其他临床特征，例如年龄较小、女性和非亚洲种族，仅在孤立研究中与ROS1重排有关。因此，临床特征不应该用于选择或排除患者检测ROS1重排。ROS1重排与其他致癌驱动因子改变（如EGFR和KRAS突变和ALK重排）相互排斥，在其他驱动因子（即EGFR，ALK，KRAS，BRAF）阴性肺腺癌中，ROS1重排的频率增加至5％～10％。
值得注意的是，年在美国ROS1重排肿瘤中的克唑替尼治疗不需要使用FDA批准的伴随诊断。已经建立的检测ROS1来选择ROS1靶向治疗的已发表的临床实用方法主要依赖于FISH和RT-PCR。在美国以外，使用RT-PCR的诊断检测主要涉及东亚国家的国际II期临床试验，用于选择ROS1重排的肿瘤。
表4.年指导意见摘要
年在美国，克唑替尼治疗ROS1重排的肿瘤不需要FDA批准的辅助诊断。选择ROS1靶向治疗建立的检测ROSI的临床效用的发表的方法主要依赖于FISH和RT-PCR。除美国外，应用RT-PCR的诊断检测主要涉及东亚国家的国际II期临床试验，用于筛选具有ROSI重排的肿瘤。该实验方法已被批准为欧洲和中国的体外诊断策略，并且在一些国家被认定为辅助诊断试验。尽管由于ROS1断裂位点（通常是内含子31～35）和配对基因的变异，靶向RT-PCR分析可能被质疑，但是只要它们在已知阳性样品上得到适当验证，基于捕获的RNA或DNA测序策略仍然可以应用。在美国，FISH方法多次被报道。考虑到多种融合伴侣，荧光原位杂交测试应使用分离探针设计进行，并应在15％或更多的肿瘤细胞中显示重排，定义为信号分裂至少1个探针直径。
2专家共识意见
ROS1IHC可用作晚期肺腺癌患者的筛查策略，而通过应用分子或细胞遗传学方法应该能够证实ROS1IHC结果阳性。
证据不足以支持使用IHC作为ROS1分子检测的筛选测定法，该声明由6项研究支持，包括2项PCSS，1项PRCS和3项RCSS。五项研究比较ROS1IHC与FISH参考检测，一项研究比较ROS1IHC与RTPCR参考检测。使用比较IHC和FISH的研究报告的真阳性、假阳性、真阴性和假阴性数据，进行MA以综合评估ROS1IHC的灵敏度和特异性（图1）。所有纳入研究进行质量评估，没有发现有方法缺陷对研究结果产生影响的担忧（SDC表8）。请参阅SDC表9，了解支持使用IHC作为ROS1分子检测的筛选实验的结果汇总。
鉴于NSCLC中ROS1重排相对罕见，在某些情况下IHC筛查可能优于FISH或分子技术。然而，对ROS1IHC的解释是具有挑战性的，因为表达可以以斑块形式被观察到，通常在弱强度下，在多达三分之一的没有潜在重排的肿瘤中可以看到。尽管一些研究表明在没有重排的情况下ROS1表达可能具有预后意义，但肿瘤细胞中的局灶性或斑片状表达很少与ROS1重排相关，因此不可能预测对ROS1靶向治疗的反应。此外，不同融合类型的染色模式可能不同，包括CD74-ROS1融合中的颗粒状球细胞染色，EZR-ROS1融合中的弱膜染色以及GOPC-ROS1融合中的囊泡定位染色。
一种市售抗体克隆（D4D6，马萨诸塞州丹佛斯的细胞信号技术公司（CellSignalingTechnology，Danvers，Massachusetts））已用于迄今公布的研究中。大多数回顾性研究使用D4D6抗体的ROS1IHC显示相对于FISH或RT-PCR的灵敏度为％。缺乏ROS1表达的肿瘤可以被安全地解释为缺乏ROS1融合。然而，使用不同的方法和解释截断值，ROS1IHC的特异性更易变，范围从92％到％不等。通过文献检索确定的5项研究的荟萃分析确定使用染色强度至少为2+（如本研究中所定义）的D4D6抗体，与FISH相比，IHC汇集的灵敏度为96％（95％CI，71％～99％），特异性为94％（95％CI，89％～96％）（图1）。已经提出了仅使用强度或H评分（强度*肿瘤细胞染色的百分比）的几种截断值。在大多数研究中，FISH或分子学确认的ROS1重排肿瘤至少具有中等强度的ROS1蛋白表达，但公开的证据不足以建议一个特定的切断或评分系统，每个实验室必须验证其已知的正面和负面样本的解释截止点。
由于与非特异性表达的解释相关的不完全特异性和挑战，推荐所有ROS1IHC阳性结果在考虑患者使用ROS1靶向治疗之前通过FISH或分子方法（即RT-PCR，NGS）进行确认。然而鉴于IHC的高度敏感性，明显缺乏ROS1染色的肿瘤可被解释为ROS1融合阴性。
图1.与荧光原位杂交相比，基于免疫组织化学（IHC）的灵敏度和特异性的森林图。基于纳入研究的双变量分析的敏感性和特异性汇总估计。所有纳入的研究均使用IHC染色强度至少为2+的D4D6抗体来定义ROS1重排阳性。缩写：FN，假阴性；FP，假阳性；TN，真阴性；TP，真阳性。
其他基因
本指南新增的基因中，只有ROS1检测必须提供给所有合适的肺癌患者。对肺癌患者进行任何扩展的多基因组检测时，应该包括以下基因的检测，无论是否为所有肺癌患者提供了专家组，或者专家组是否保留作为EGFR/ALK/ROS1野生型患者寻求临床试验。
3.专家共识意见
目前，BRAF分子检测在临床试验以外并不是一项常规的独立检测。将BRAF作为开始时或当常规EGFR、ALK和ROS1检测结果为阴性时进行的大型检测的一部分是恰当的。
证据不足以支持使用BRAF分子检测，该声明是有依据的，并有9项研究的支持：4项PCS和3项RCS，所有这些都报告了BRAF突变与患者或肿瘤特征之间的关联，以及另外两项在p.VE突变患者中非随机临床试验评估BRAF抑制剂的活性。所有纳入的研究都进行了质量评估，没有发现任何方法缺陷引起对研究结果的质疑（SDC表10）。请参阅SDC表11，以获得支持使用BRAF分子检测的研究结果的总结。
在BRAF中的活化突变，特别是p.VE，通过MAPK引起致癌信号传导，并且是肺腺癌中罕见的复发改变，见于0.5％至4.9％的肿瘤。在年第二期单臂临床试验中，数据显示：（1）第二线给予单药达拉非尼至IV期BRAFp.VE突变NSCLC的部分缓解率为33％，疾病控制率为58%；（2）联合使用达拉菲尼-曲美替尼作为IV期BRAFp.VE突变型肺腺癌的二线治疗，部分缓解率为63％，疾病控制率为75％。
根据这些数据，FDA为BRAFp.VE突变阳性非小细胞肺癌的联合治疗提供了突破性治疗指南，并于年获得了FDA批准。因此，这是工作小组所有建议中最具争议的，虽然工作组强烈建议BRAF突变分析应在肺腺癌初始分子检测时进行，但公布的可用的证据缺乏对照前瞻性试验，因此国际上推荐所有肺腺癌患者进行BRAF单基因检测缺乏一定力度。我们期望发布更加强有力的证据支持BRAF抑制BRAF突变肺癌的实用性，BRAF检测将被证明是必要的。预计本指南的下一版本将包括建议BRAF与EGFR、ALK和ROS1一起进行单基因检测，但无法在年春季提出该建议。尽管独立单基因检测尚未推荐检测BRAF，如果开始使用小组策略，或者对于EGFR、ALK和ROS1野生型患者，则应包括BRAF。
与EGFR和KRAS突变一样，BRAF中选择的热点突变发挥致癌作用。V-raf鼠肉瘤同源物b（BRAF）基因编码RAS和MEK之间的MAPK激酶信号传导途径中的非受体丝氨酸-苏氨酸激酶。NSCLC中最常见的BRAF突变是c.TA（p.VE）点突变，它是许多其他癌症（包括黑色素瘤，乳头状甲状腺癌，结肠直肠癌，毛细胞白血病和神经节胶质瘤）的主要突变。然而，与其他具有BRAF突变的癌症相反，肺癌通常具有非p.VEBRAF突变，包括密码子处的其他突变（例如p.VK）和外显子15中的邻近密码子，以及密码子和处的替代在外显子11。
像肺癌中许多其他靶向的致癌基因一样，BRAF突变在腺癌中比在鳞状细胞癌中更常见。在一些研究中BRAFp.VE突变在女性和不吸烟者中更为常见，但一些研究未能显示这些联系。BRAF突变与其他可靶向致癌基因之间的一个区别是非p.VEBRAF突变（特别是外显子11突变）可与KRAS中的突变共存，而p.VE突变与KRAS，EGFR或ALK改变相互排斥。
BRAF的单基因检测广泛用于其他类型的癌症，特别是对于考虑用于靶向治疗的黑色素瘤患者，但大多数这些方法不能检测到在肺癌中发现的外显子11突变。尽管支持BRAF检测实用性的证据仅限于p.VE突变，但我们认为，作为大型专家组或临床试验招募的一部分进行的BRAF检测应该使用一种评估方法，该方法在最低外显子11和15。
类似的挑战出现在使用突变特异性IHC使用针对抗体的抗体p.VE突变蛋白（VE1），已广泛用于黑色素瘤的诊断。少数肺癌病例报道的数据表明，VE1克隆可染色90％至％的p.VE突变型腺癌。其中1项研究中，所有非p.VE病例在IHC检测中均为阴性，而在另一项中，21例中单个非p.V突变病例（具有独特的插入T突变）显示阳性染色。目前没有足够的证据支持针对非小细胞肺癌中BRAFp.VEIHC（VE1）检测的建议。
4.专家共识意见
在临床试验的范围之外，RET分子检测不推荐作为常规独立检测。将RET作为开始或常规EGFR、ALK和ROS1检测结果为阴性时进行的大型检测的一部分是合适的。
支持使用RET分子检测的证据力度不足，本声明是有依据的，由3项研究支持，包括1个PCS和2个RCSs。所有纳入的研究都进行了质量评估，没有发现任何方法缺陷引起对研究结果的质疑（SDC表12）。请参阅SDC表13，了解支持使用RET分子检测的研究结果的总结。
导致RET融合的结构变异很少见，在0.6％至0.9％的非小细胞肺癌和1.2％至2％的腺癌中出现。虽然小系列和病例报告显示了前景，正在II期临床试验中探索用RET激酶抑制剂治疗RET阳性肺癌的可能性。鉴于RET重排的稀有性和治疗益处的有限证据，RET变化的检测不推荐作为所有肺腺癌患者的独立检测。然而，为肺癌患者开发的任何大型多基因小组试验，无论是初步检查还是野生型EGFR、ALK和ROS1患者，都应包括RET。
与ALK和ROS1重排一样，RET通过重排将RET的酪氨酸激酶结构域与多种重复配偶体基因之一的卷曲螺旋二聚体结构域（包括KIF5B（最常见的，在90％）、CCDC6、NCOA4和TRIM33）。RET重排与EGFR，KRAS，ALK，HER2和BRAF在肺癌中的异常相互排斥。
不吸烟者比任何吸烟者更频繁地发生RET融合。携带肿瘤的RET融合蛋白的患者通常比具有EGFR突变并具有相同性别的患者更年轻。已在腺癌和腺鳞癌中检测到了RET融合蛋白。腺癌中的组织学亚型包括具有粘液/印戒细胞和那些具有筛状或固体生长模式的那些亚型。然而，应该使用临床或组织学特征（除了检测纯粹的鳞状组织学病例以外）来选择RET检测的患者。
多种方法已应用于RET分析，包括FISH分析，IHC，RT-PCR和NGS。由于常见融合类型中分裂探针信号之间的间距较窄，RETFISH特别具有挑战性，分离RET信号的模式只有1个信号直径距离被解释为正值。与通过FISH进行ALK重排检测相似，RETFISH重排阳性的阈值是具有分裂信号或单个3探针信号的细胞的15％。在另一项研究中，使用4色RETFISH检测；如果超过20％的肿瘤细胞分别呈现分裂的红绿信号或接触金-绿信号，则样品为RET重排或KIF5B-RET融合的阳性。
一项最近的回顾性研究使用RETIHC（抗RET抗体ab134，Abcam，Cambridge，UnitedKingdom）显示弥漫性颗粒状细胞质染色和偶尔膜性或核周染色，具有中等强度。报道了％的灵敏度和88％的特异性，虽然确凿证据不足以证明建议。
尽管多重RT-PCR对涉及KIF5B-RET和CCDC6-RET的常见融合体可能是成功的，与ALK和ROS1一样，单独的靶向RT-PCR通常不足以检测新的配偶体或同种型。然而，尽管ALK和ROS1中可治疗的重排的多样性已经通过多年的测试和临床试验充分成熟，例如这些基因的靶向RT-PCR测定可以设计成具有足够的临床敏感性，但可治疗的RET重排的多样性是早期的进展。基于捕获的测序方法，涉及DNA或RNA，可能更灵敏，更容易整合到大型多基因组中。
5.专家共识意见
ERBB2（HER2）分子检测未在临床试验背景下作为常规独立检测。将ERBB2（HER2）突变分析作为开始时或常规EGFR、ALK和ROS1检测结果为阴性时进行的较大试验组的一部分是适当的。
证据不足以支持使用ERBB2（HER2）分子检测。这项建议是有依据的，并得到了10项研究的支持，这些研究报告了ERBB2（HER2）与患者或肿瘤特征之间的关联，以及1评估ERBB2（HER2）突变患者使用ERBB2靶向治疗（达克替尼）和放大。所有纳入的研究都进行了质量评估，没有发现任何方法缺陷会引起对研究结果的质疑（SDC表14）。请参阅SDC表15，了解支持使用ERBB2（HER2）分子检测的研究结果的总结。
人类表皮生长因子受体2基因（HER2，ERBB2）的改变已经成为致癌驱动因素，并成为肺癌潜在的治疗靶点。在这种情况下发生序列改变和基因扩增，分别占报道的反复改变的约2％至3％和2％至5％。HER2（ERBB2基因的蛋白质产物）的治疗靶向在此时仍然是一个积极研究的领域。早期的基于IHC蛋白表达或FISHERBB2扩增选择患者的临床试验并没有显示出明显的益处。另一项使用ERBB2突变和ERBB2扩增进行患者选择的II期临床试验显示，对达克替尼有持久的反应，但仅限于具有特定HER2突变的患者。
外显子20中的框内插入和S上的替换是最常见的突变，通常与其他反复发生的改变相互排斥，包括EGFR、KRAS和BRAF的突变，以及涉及ALK和ROS1的重排。外显子20中的插入是可变的，其中大部分是12-碱基对重复的编码氨基酸YVMA的密码子-，且在年轻患者和无吸烟史患者中更常见。在有或没有ERBB2突变的情况下，ERBB2的新增扩增可能发生，报道的共同发生率从0％到87％不等。独立于ERBB2突变的ERBB2扩增发生率表明突变和扩增可能代表肺癌中不同的标志物和治疗靶点。ERBB2扩增很少被报道为EGFR突变致敏患者的继发事件，也是EGFR抑制剂治疗后耐药的潜在机制。
在这种情况下，根据目前的证据，ERBB2突变的常规独立检测并未在临床试验之外进行。尽管如此，当通过多重检测或NGS进行更广泛的检测时，包含ERBB2作为检测的一部分是合适的，因为它可以鉴定患者针对临床三联体——在这种情况下，检测ERBB2中的序列改变，特别是在外显子20中的插入/重复，这与在报告和小系列中针对ERBB2的靶向抑制剂的治疗的反应相关。
6.专家共识意见
KRAS分子检测不是作为常规单独检测作为靶向治疗的唯一决定因素。将KRAS分子检测作为初始或常规EGFR、ALK和ROS1检测阴性时进行的大型检测板的一部分是合适的。
证据强度足以支持在选择靶向治疗的患者时使用KRAS分子检测，支持使用任何临床特征来确定应接受KRAS检测的患者的证据力度不足。这项声明是有依据的，并得到7项研究的支持，其中包括2项MAs，4项PCS和1项RCS。五项研究试图确定患者或肿瘤特征与KRAS突变状态之间的关联。当KRAS突变阳性患者接受标准护理治疗时，两个MA报告了总生存期和EGFR-TKI应答率。所有纳入的研究都进行了质量评估，没有发现任何方法缺陷会引起对研究结果的质疑（SDC表16）。参考SDC表17以获得支持使用KRAS分子测试的研究结果的总结。
报道20％至30％的肺腺癌中有KRAS突变。KRAS突变在烟草使用者中更常见，但约有5％的肺癌患者从未使用过烟草。大多数研究表明，与女性和亚裔男性相比，男性和白人或非洲裔的发病率增加。KRAS突变在密码子12和13中最常出现，在密码子61中很少见，在密码子中罕见，并且可以通过快速靶向热点检测（即实时PCR，液滴数字PCR，或焦磷酸测序）询问这些密码子，以及并入更大的小组检测中。它们通常与其他驱动突变如EGFR突变和ALK重排相互排斥。
针对突变KRAS的治疗尚未证明临床有效。例如，尽管在KRAS突变型晚期肺癌患者的II期研究中获得了有希望的结果（37％的客观缓解率），但是这一组合未能证实结果司美替尼评估作为联合治疗-1（SELECT-1）III期临床试验和司美替尼+厄洛替尼治疗KRAS突变型肺癌的II期研究未能显示出对厄洛替尼不依赖的司美替尼的反应。因此，针对这种常见突变的治疗策略的深入研究仍在继续，将KRAS纳入用于指导患者接受研究治疗的较大试验小组是适当的。
KRAS突变检测的另一个应用是顺序检测算法，其阳性结果大大降低了另一种可靶向致癌性改变的可能性。然而，如果在EGFR、ALK或ROS1检测之前进行KRAS检测，实验室必须确保在推荐的时间内有充分的肿瘤可用于EGFR、ALK和ROS1检测，特别是在KRAS结果为阴性的情况下。类似地，KRAS和其他癌基因如RET、ERBB2（HER2）和BRAF相比突变较少。在这种情况下，一项快速针对性的KRAS检测可能有助于确定EGFR/ALK/ROS1野生型患者是否能够通过扩大的检测获益，因为检测结果不太可能有益于KRAS突变癌症患者。然而，随着技术的发展而发生变化，因为更新的超灵敏方法已经显示驱动癌基因（包括KRAS）在肿瘤内的亚群中共同出现，这些亚群之前并未通过较不敏感的方法检测到。
7.专家共识
MET分子检测在临床试验中不是常规独立检测。将MET作为初始或常规EGFR、ALK和ROS1检测结果为阴性。证据的力量不足以支持使用MET分子检测。该声明是基于证据的，并得到7项研究的支持，其中包括1项MA，1项II期随机对照试验，1项PCS和4项RCS。所有纳入的研究都进行了质量评估，没有发现有任何方法学上的问题会引起对研究发现的担忧。
最初报道，作为EGFRTKI治疗在EGFR突变型肺癌中继发耐药的机制，理解MET激活机制和MET检测在肺癌中的作用已经经历了几个阶段。MET复制增益最初被认为与对EGFR抑制剂的继发性耐药有关，这促使开发出显示令人失望的结果的靶向治疗。最近，对靶向MET抑制作出反应的活化突变的发现的兴趣而重新燃起。
MET基因编码肝细胞生长因子（HGFR）受体，其活化在促进细胞存活、增殖、运动性、侵袭和上皮-间质转化中具有多种功能。HGFR可以通过几种不同的机制被激活并驱动肿瘤发生，包括导致受体高表达的扩增，导致受体组成性激活的酪氨酸激酶结构域突变，以及导致外显子14跳跃和Y3丧失的剪接突变，泛素介导的蛋白质降解所需的CasitasB系淋巴瘤原癌基因（CBL）结合位点。虽然大多数外显子跳跃突变涉及经典剪接位点，但一些位于内含子序列的更远处，因此可能难以解释，或者可能通过仅检查外显子和紧邻的50和30剪接受体和供体位点。
激活MET改变被克唑替尼抑制，这是一种治疗ALK和ROS1重排肺癌的疗法。尽管报道MET基因扩增和高蛋白表达作为不良预后标记的关联，最近有报道称MET扩增或MET外显子14突变在某些情况下对克唑替尼敏感，目前还没有批准的靶向治疗来治疗这些MET基因组异常的肿瘤患者。在这种情况下，对于这些MET基因组异常或HGFR蛋白水平的常规独立检测未在临床试验之外进行。然而，当对肺癌患者进行假定的致癌驱动突变的多重检测时，无论是最初检测EGFR/ALK/ROS1或结果为阴性时，这些MET基因异常都应纳入检测。
迄今为止，已经描述了导致MET外显子14跳跃。突变表现出高度多样化的序列组成，包括主要位于剪接供体和受体位点的小插入、缺失、复合插入和单核苷酸变体。内含子中更深的点突变，与剪接受体位点相邻的多达25个碱基对进入内含子非编码区域，也以较低频率报道，尽管许多检测不涉及该区域。一般来说，这些最不常见的外显子剪接突变的总体发病率和效应尚未明确。
鉴于影响MET外显子14突变的广泛变异性和复杂性，根据所使用的方法，全面的诊断检测可能证明具有挑战性。更倾向于针对基于NGS的检测MET作为更广泛基因组的一部分的筛选目的。对于DNA检测，设计应该能够对外显子14及其启动子内含子进行准确和完整的测序。新的突变，特别是那些影响与剪接位点相邻但深入内含子的区域的改变可能需要使用基于RNA的测定来确认外显子14跳跃。或者，也可以使用基于RNA的先期试验来评价MET，作为设计用于全面评估结构变体或基因表达的更广泛基因区的一部分。
荧光原位杂交传统上用于临床中检测基因扩增。目前，肺癌标本中没有关于MET阳性界限的指导原则。通过使用MET：CEP7比例低（≥1.8至2.2）、中等（2.2至5）和高来分类MET扩增。METFISH阳性标准的其他实例包括每个细胞5个或更多MET信号和MET：CEP7比例为2或更高（PathVysion，AbbottPark，Illinois）。MET放大的低和中等水平可与其他致癌物同时发生突变和基因重排（KRAS、EGFR、BRAF、ERBB2[HER2]、ALK、ROS1、RET）高达63％的肺癌。然而，这种重叠在高MET扩增肿瘤（MET：CEP7比率≥5）中没有观察到，这表明MET扩增可能是真正的致癌驱动。这组具有高水平扩增的肿瘤显示出对克唑替尼的反应，而在低或中等水平扩增的肿瘤中没有反应。重要的是，约20％的具有MET外显子14-跳跃突变的肺腺癌具有同时的高水平MET扩增，混淆了解释。关于单独修饰的重要性，病例报告已经显示对克唑替尼的反应。
在确定对EGFRTKI获得性耐药存在的MET扩增阳性临床有效截断时存在同样的挑战。最近的II期研究显示，当吉非替尼和卡马替尼联合治疗时，MET拷贝数为5或更高，获得性EGFRTKI耐药患者的反应率为40％；MET拷贝数小于5的组没有观察到反应。
在福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品上进行的MET蛋白表达的免疫组织化学一直是肺癌标本中最常用的方法。许多商业上可得到的单克隆和多克隆抗体针对MET的不同表位，对于总MET和磷酸化MET具有不同的灵敏度和特异性。用于MET评估的免疫组织化学程序和评分方法尚未标准化。因此，非选择性NSCLC病例中MET蛋白过表达的范围从20％至70％。一项荟萃分析发现NSCLC中免疫组化分析的MET表达是手术切除NSCLC患者中的负面预后因素。常用的抗体，特别是在临床试验中，是针对MET的膜和细胞质表位的CONFIRM抗全MET（SP44）兔单克隆一抗（VentanaMedicalSystems，Tucson，Arizona）。在公布时，尚不清楚是总MET还是磷酸MET蛋白过表达代表MET活化的可靠指标。METIHC和FISH都不能预测onartuzumab联合厄洛替尼在晚期NSCLC患者中的有效性。
其他基因
肺癌复发改变的范围在不断发展，并且已报道了几项有希望的改变，但本建议中未包括。这包括涉及NTRK和FGFR家族中的基因的融合体，两者均具有实验性靶向抑制剂，并具有体外数据和病例报告的支持。没有指南可以完全及时更新，建议肺癌护理的从业者及时了解这些和其他发展。表5包括用于肺癌分子检测的新兴生物标志物列表。
表5新兴的肺癌分子检测标志物
Tobecontinued···
陈锦飞崔笑文等人赞赏
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