干货分享丨糖尿病动物模型解析

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大家好，我是小欧。在上期的干货分享中，我与大家分享了动物模型的一些基本知识，那么接下来，我将为大家讲解一系列动物模型的重点知识。

本期，我与大家分享的是糖尿病动物模型构建的实验方法。

首先，我们先来了解一下糖尿病。

糖尿病(diabetesmellitus,DM)是一种由多种病因引起的慢性代谢性疾病,是由于体内胰岛素缺乏,或拮抗胰岛素的激素增高,或胰岛素在靶细胞内不能发挥正常生理作用而引起葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的综合征。

临床上分为胰岛素依赖型糖尿病(isulindependentdiabetesmellitus,IDDM)即1型和非胰岛素依赖型糖尿病(non-isulindependentdiabetesmellitus,NIDDM)即2型,

1型糖尿病：病理学特征为胰岛β细胞数量显著减少和消失所导致的胰岛素分泌显著下降或缺失。

2型糖尿病：病理学特征为胰岛β细胞功能缺陷所导致的胰岛素分泌减少（或相对减少）或胰岛素抵抗所导致的胰岛素在机体内调控葡萄糖代谢能力的下降或两者共同存在。

建立糖尿病动物模型对研究糖尿病有重要的作用。本文介绍几种糖尿病动物模型，分为自发性、诱发性、转基因糖尿病动物模型，大家要根据研究的疾病背景选择正确的模型。

诱发性糖尿病动物模型

1、四氧嘧啶诱发

四氧嘧啶(Alloxan)是一种特异的胰岛细胞毒剂,可选择性地损伤多种动物的腠岛B细胞,引起实验性糖尿病，它常用于制备1型糖尿病动物模型。

造模方法:给动物一次性静脉或腹腔注射1%～5%的Alloxan水溶液～mg/kg

机制:四氧嘧啶进入体内后能迅速被胰岛β细胞摄取，影响细胞膜的通透性和细胞内ATP的产生，抑制葡萄糖介导的胰岛素分泌。

四氧嘧啶主要通过产生氧自由基破坏β细胞结构，导致细胞的损伤及坏死，从而阻碍胰岛素的分泌，使血清胰岛素水平降低。

因四氧嘧啶同时也造成肝、肾组织中毒性损害；另外，部分采用四氧嘧啶制造的DM动物模型可自发缓解，故目前已经很少应用。

优点:用药量少,操作方法简便且价廉。由血浆半衰期仅12min,故能快速成模,且注射速度越快成模率越高。

缺点:大剂量的Alloxan可致动物酮症酸中毒而死亡,可致肝、肾组织中毒性损害。因此,使用Alloxan制备糖尿病模型时要严格控制剂量。

注意事项:Alloxan水溶后不稳定,应现用现配。

2、链脲佐菌素（streptozotocinSTZ）诱发

STZ是一种药效强大的烷化剂,能干扰葡萄糖的转运,影响葡萄糖激酶的功能,诱导DNA双链的断裂。

造模方法:

1)迟发型:大鼠第1天腹腔注射福氏佐剂15mL,次日按25mg/kg腹腔注射Stz溶液,每周1次,连续3周。此模型接近人类1型糖尿病。

2)速发型：选用雄性或雌性Wistar大鼠，体重g左右，注射STZ25～30mg/kg(静脉注射，配制方法同前)，2～3周后测定葡萄糖耐量，挑选糖耐量异常者，喂以高脂饲料(基础饲料加蔗糖、炼猪油、鲜鸡蛋等混合而成。

含蛋白质15％～18％，碳水化合物51％～54％，脂肪22％～25％，热量为20.08kJ/g)，动物单个喂养，以保证每个动物进食量，喂10～18周。

一个月后，测定24小时摄食量、体重、血压、非禁食血糖、血浆胰岛素、血甘油三酯和胆固醇水平，并行胰岛素抑制试验以评价胰岛素敏感性。

机制：

①STZ直接破坏胰岛β细胞：主要见于注射大剂量STZ后。STZ注射后可引起β细胞内辅酶I（NAD）的浓度下降，NAD依赖性能量和蛋白质代谢停止，导致β细胞死亡。

②通过诱导一氧化氮（NO）的合成，破坏胰岛β细胞；

③STZ激活自身免疫过程，进一步导致β细胞的损害：小剂量注射STZ可破坏少量胰岛β细胞，死亡的胰岛β细胞可作为抗原被巨噬细胞吞噬，产生TH1刺激因子，使TH1细胞系占优势而产生IL-2及IFN-γ。

在胰岛局部促使炎性细胞浸润，并活化释放IL-1、TNF-α、IFN-γ、NO和H2O2等物质杀伤细胞。死亡细胞又可作为自身抗原，再次递呈给抗原递呈细胞进行处理，释放细胞因子,放大细胞损伤效应，最终诱发DM。

优点：stz对组织毒性小，诱发动物糖尿病模型成功率高，且一般不表现自发性缓解。小剂量STZ及高脂饲料喂养是形成该大鼠模型的必要条件。实验周期短，费用低。诱导的2型糖尿病模型症状和发病机制与人类2型糖尿病非常相似。

缺点：stz剂量过大易导致动物死亡。因多尿，高糖，体重明显减轻，故体重较轻的动物易死亡。

注意事项：利用stz造模时应该控制剂量，stz必须4摄氏度保存及新鲜配制。

自发性糖尿病动物模型

自发性糖尿病动物模型是指动物未经过任何有意识的人工处置，在自然情况下发生糖尿病的动物模型。该模型绝大多数采用有自发性糖尿病倾向的近交系纯种动物,如BB鼠、NOD小鼠、GK鼠和中国地鼠等动物造模。

可分为两类：一类为缺乏胰岛素，起病快、症状明显，并伴有酮症酸中毒，如BB鼠、NOD小鼠和LETL大鼠，它们可以作为1型糖尿病的动物模型使用。

另一类为胰岛素抵抗性高血糖症，其特点是病程长，不合并酮症，为2型DM动物模型。常用的2型DM自发性动物模型有ob/ob小鼠、db/db小鼠、NSY鼠和OLETF大鼠等。

1、BB大鼠

选育自Wistar大鼠，是Ⅰ型糖尿病的良好模型。其发病与自身免疫性毁坏胰岛β细胞引发胰腺炎和胰岛素缺乏有关。

特征：

1）雄性与雌性大鼠发病率相当。

2）BB大鼠一般于60～日龄时发生DM，发病前数天可见糖耐量异常及胰岛炎。

3）体重减轻、多饮、多尿、糖尿、酮症酸中毒、高血糖、低胰岛素、胰岛炎等。

4）血液中淋巴细胞减少，易于感染。

2、NOD小鼠

年日本Shionogi研究实验室的MakinoS等首次报道非肥胖型糖尿病小鼠品系。该品系小鼠是自发胰岛素依赖性糖尿病小鼠品系，也就是人类Ⅰ型糖尿病的动物模型。

特征:

1）胰岛素依赖性的一型糖尿病。2）雌性的糖尿病发病率高于雄性。3）伤口治愈能力低下。4）免疫系统异常。

3、ob/ob小鼠

ob/ob小鼠为Ⅱ型糖尿病模型。纯合子动物表现肥胖、高血糖和高胰岛素血症。该小鼠因Leptin(ob基因产物)缺乏而引起肝脂肪生成和肝糖原异生，高血糖又刺激胰岛素分泌，引起胰岛素抵抗的恶性循环。

特征:1）4周开始呈现出肥胖,之后体重急速增加。2）肥胖后,食过量,高血糖,高胰岛素血症,妊娠能力低下,伤口职业能力低下,代谢低下等。3）脂肪细胞的数量和体积增加。4）限制食物量也可以导致体重过度增加和过度的脂肪堆积.(考虑是由于高胰岛素血症导致的体重增加)5）高血糖不稳定性.年幼的ob/ob小鼠也有不肥胖的时候,考虑可能是因为胰岛素分泌的刺激阈值异常的低下造成的.在14-16周龄时候,出现一过性的血糖低下。

4、db/db小鼠

db/db小鼠是美国Jackson实验室于年发现的位于4号染色体的Leptin受体基因缺陷导致的自发性2型糖尿病小鼠。

特征:1）从3-4周开始呈现出肥胖体征.血浆中胰岛素从10-14天开始增加,血糖值从4-8周开始急速增加.2）呈现出多饮,多食,多尿。3）血糖值高度上升后,胰岛中分泌胰岛素的beta-细胞被观察到消耗严重。4）平均寿命约10个月。5）末梢神经系统,心血管系统,免疫系统,糖尿病性肾病等均可观察到阳性变化。6）伤口愈合缓慢,代谢效率亢奋。

转基因糖尿病动物模型

转基因糖尿病动物模型主要分为传统的转基因方法和基因打靶方法。将胰岛素信号转导通路中的某个基因敲除，得到理想的糖尿病动物模型。此外，用Cre/Loxp系统与基因打靶技术相结合，可以得到组织或细胞特异性靶细胞被敲除的动物模型。该模型主要有GK/IRS-1双基因剔除小鼠、MODY动物模型、GDM（妊娠糖尿病）模型。

1、GK/IRS-1双基因剔除小鼠

IRS-1-/-小鼠表现为胰岛素抵抗，但由于β细胞代偿性增生，胰岛素分泌增多，糖耐量正常。β细胞特异GK表达降低的小鼠，显示轻度糖耐量异常。

两者杂交产生的GK/IRS-1双基因剔除小鼠，表现Ⅱ型糖尿病症状，既有胰岛素抵抗又有糖耐量异常。

2、IR+/-/IRS-1+/-

双基因剔除杂合体小鼠IR+/-和IRS-1+/-单个基因剔除的杂合体小鼠无明显的临床症状。而IR+/-/IRS-1+/-小鼠肝和肌肉中IR和IRS-1表达水平下降60％，由胰岛素介导的IR自动磷酸化，IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化，P13-激酶的P85亚基与IRS-1的结合都减少。

4～6个月前血糖正常，2个月时胰岛素水平升高，4～6个月时，发生明显的胰岛素抵抗(表现为血胰岛素水平显著升高和对外源性胰岛素不敏感)，6个月时，40％的杂合体双突变鼠表现糖尿病症状。

3、MODY3模型

MODY，即青幼年发病的成年型糖尿病，是Ⅱ型糖尿病的一个亚型，有5种蛋白质的基因缺失或突变可以导致MODY，分别是肝细胞核因子4a，葡萄糖激酶，肝细胞核因子1a，胰岛素启动因子，肝细胞核因子1β。

β细胞特异HNF-1a突变的转基因动物，可特异抑制β细胞HNF-1a的功能，雄性表达突变蛋白者在6周龄时出现糖尿病症状，胰岛素分泌功能受损，雌性糖耐量异常。糖尿病鼠胰岛内胰岛素水平显著下降，高血糖素水平升高。

动物出生后胰岛生长方式改变(a细胞/β细胞比值升高)，β细胞超微结构显示包括线粒体肿大在内的β细胞严重损伤。

吉妮欧生物实验服务1、服务项目

动物造模

动物实验检测项目

2、服务流程

1）构建模型；

2）药效学评价，动物组织及血液标本采集；

3）后续各项指标检测包括：血液生化，组织病理学评价，蛋白、基因相关检测。

3、实验交付

客户提供：

1）药物或其他实验材料

2）动物模型及方案的选择

3）其他技术要求

我们提供：

1）实验过程图像资料；

2）组织、血液样本。

3）实验报告（主要仪器及试剂说明，实验步骤，实验结果）

吉妮欧生物动物造模实验示例

c57小鼠

裸鼠

实验室介绍

广州吉妮欧生物有限公司是一家立足于生物医药技术研发，服务于各大科研院校、医院和药企，致力于临床转化和产业化应用的高新技术公司。

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