ShileiLiu,RuiWang,YangZhang,YuanLi,ChaoCheng,YunjianPan,JiaqingXiang,YaweiZhang,HaiquanChen,andYihuaSun
摘要
目的：本研究探讨应用术中冰冻切片(FS)诊断周围型小病灶肺腺癌最终病理（FP）的准确性，并评估其在亚肺叶切除术中的价值。
对象和方法：本研究回顾分析手术切除的例临床Ⅰ期周围型肺腺癌患者，所有患者均先行亚肺叶切除，根据术中冰冻切片（FS）结果确定是否行扩大手术。FS诊断分为非典型腺瘤样增生(AAH)、原位腺癌(AIS)、微浸润腺癌(MIA)、浸润型腺癌。评估FS诊断的准确性、术中冰冻结果（FS）与最终病理结果（FP）的差异原因和FS误差对临床治疗决策的影响。并选取例患者进行生存分析，了解不同亚型肺癌术后患者的生存状况。
结果：FS和FP诊断的一致率总体达84.4%。将AAH、AIS和MIA合并为低危组后，FS和FP的一致率高达95.9%。出现误差的病例多为对AIS和MIA的错分。FS诊断准确性与肿瘤大小有关，对于直径≤1cm和1cm的肿瘤，FS的诊断准确率分别为79.6%和90.8%(P0.01)。例患者中仅有7例（0.9%）患者存在因切除不足所致FS误差，对临床治疗决策有明显影响。AIS/MIA患者5年无复发生存率（%）明显优于浸润型腺癌患者(%vs74.1%，P0.01)。
结论：术中冰冻切片(FS)结果与最终病理诊断(FP)有较高的一致率，FS的精准诊断是指导周围型小病灶肺腺癌手术决策的有效方法。
引言
随着薄层和低剂量计算机断层扫描（CT）技术的发展，周围型小病灶肺癌的检出率不断提高1。尽管肺叶切除术仍是目前早期非小细胞肺癌（NSCLS）的标准手术方式2，但是一些研究显示，对于周围型小病灶NSCLS患者而言，选择性的亚肺叶切除术可以为患者带来相对更好的预后3-6。它在保留患者肺功能、降低围手术期的并发症和死亡率和创造二次手术切除原发肿瘤等方面均具有优势7。因此，亚肺叶切除术在早期NSCLS治疗中发挥着重要的作用。
目前还没有明确规范亚肺叶切除术的最佳适用患者人群。手术医生主要通过CT扫描和其他影像学表现，如肿瘤大小、磨玻璃样变（GGO）中固体成分的百分比、以及正电子发射断层扫描（PET）/CT断层扫描的病变特征来判定患者是否可以进行亚肺叶切除5,8,9。总之，还没有统一标准来界定亚肺叶切除术的适用范围。有研究显示，肺部周围型病灶的直径≤2cm患者是局限性肺切除的最佳人群6,10。还有研究建议，磨玻璃样变（GGO）临床分期IA的肺腺癌患者，T1a的肿瘤病灶采取楔形切除术，T1b的肿瘤病灶采取肺段切除术5。亚肺叶切除在清扫N1组淋巴结方面具有很大局限性，适用于影像学评估淋巴结阴性和无侵袭性的NSCLC。我们之前的研究结果提示肿瘤的大小并不是评估淋巴结状态的可靠指标11。临床I期，肿瘤直径≤2cm的NSCLC的N1、N2淋巴结受累的发生率分别为5.3%和6.6%。即使肿瘤大小在1cm以内，N2阳性率为3.8%，类似结果其他学者也有报道12,13。根据国际肺癌研究协会(IASLC)、美国胸科学会(ATS)以及欧洲呼吸学会(ERS)新修订肺腺癌的分类标准14，原位腺癌（AIS）和微浸润腺癌(MIA)往往不会扩散至区域淋巴结和出现转移，AIS/MIA患者无病生存率接近%。而浸润型腺癌由于侵袭性更强，因此患者预后更差15,16。AIS/MIA患者可能是亚肺叶切除术的潜在适应人群。通过回顾分析小病灶NSCLC的影像学特征确定其侵袭能力有一定作用17-20，但是无法应用这些不确定因素来指导手术术式。因此，还需要进一步提高影像学技术的诊断水平和精准性。
术中冰冻切片常规用于评估病变性质不明的肺部病灶和指导术式。局限性肺切除必须充分切除肿瘤，因此术中冰冻诊断的准确性是重中之重21。自年起，医院术中冰冻切片(FS)不仅确诊恶性肿瘤，还根据IASLC/ATS/ERS新修订的标准，对肺腺癌亚型进行分类，原位腺癌(AIS)、微浸润腺癌(MIA)和浸润型腺癌。基于术中冰冻切片(FS)的诊断结果，选择亚肺叶切除术治疗周围型小病灶肺腺癌的患者。本研究就是探讨应用术中冰冻切片(FS)结果预测最终病理(FP)结果的准确性，并评估其在亚肺叶切除术中的价值。
对象和方法
对象
本研究是由上海医院的机构审查委员会批准的，因为是回顾性研究，所以不需要知情同意。该研究纳入年1月～年12月行亚肺叶切除肺部包块的例患者，根据术中冰冻切片(FS)结果指导手术术式。排除标准见图1。共有例临床Ⅰ期周围型肺腺癌(≤3cm)患者符合我们的入组标准，其中例患者行亚肺叶切除术，例行亚肺叶切除术+补充性肺叶切除术。术前检查（大多数患者行增强胸部CT扫描，腹部CT扫描或超声检查，头颅磁共振成像或CT，核素骨扫描，其余患者行PET/CT检查）评估临床分期。对于肺部小或深的病灶，通过CT引导Hookwire（带钩钢丝）术前定位，明确切除区域。外科医生根据术中冰冻病理结果(FS)，确定患者手术切除范围。若术中冰冻病理为浸润型腺癌患者，视患者身体状况则继续进行补充性的肺叶切除术。若术中病理示非典型腺瘤样增生(AAH)、原位腺癌(AIS)、微浸润腺癌(MIA)，则不需要进行补充性的肺叶切除。
术中冰冻切片(FS)的病理诊断和组织学分类
外科医生行亚肺叶切除肿瘤后，病理科医生立即对标本做冰冻切片(FS)病理诊断。切片肿瘤最大径取样，常规取每个标本的两个切片做术中冰冻诊断。根据IASLC/ATS/ERS新修订的标准，如果病变诊断为腺癌，还需亚型分类，区分是非典型腺瘤样增生(AAH)、原位腺癌(AIS)、微浸润腺癌(MIA)和浸润型腺癌中的哪一种。新分类同样适用石蜡病理诊断，根据占最大比例的组织学成分确定病理类型。
临床病理特点
收集患者的临床资料，包括性别，手术年龄，新鲜标本大小，结节部位，切除术式，术中冰冻切片(FS)结果和最终病理(FP)结果。评估术中冰冻切片(FS)诊断的准确性、术中冰冻结果（FS）与最终病理结果（FP）的差异原因和术中冰冻切片误差对临床治疗决策的影响。
患者的随访
按照统一的纳入和排除标准，选取.10～.12期间的患者，评估患者术后不同肺腺癌病理亚型的预后。之所以选取.10～.12这个时间段，是因为年～年期间治疗的患者生存数据还不够成熟，不适合做生存分析。病理科医生回顾分析年前的所有石蜡病理标本，按照IASLC/ATS/ERS新修订的标准做出新诊断。选取年10月～年5月符合入组条件的例临床I期肺腺癌患者进行生存分析（附录图A1，仅在线）。所有患者从手术即日起开始随访。术后2年内，随访内容包括每3个月进行体格检查、胸部CT扫描和腹部B超检查。到了第3年随访频率改为每6月一次，以后则每年1次。头颅磁共振成像或CT扫描和核素骨扫描每年检查1次。选择复发时间做为首个观察终点，因为它更能准确反映肿瘤的生物学行为。无复发生存（RFS）是指从手术到第一次复发或最后一次随访的时间段。总生存（OS）是指从手术到患者由于任何原因死亡或最后一次随访的时间段。
统计分析
应用皮尔森的X2检验比较分类变量的频率。配对样本t检验或方差分析比较组间的连续变量。无复发生存（RFS）和总生存（OS）用K-M生存曲线分析。对数秩和检验比较不同组间的RFS和OS的差异。P＜0.05为统计学有差异。采用SPSS19版软件（SPSS，芝加哥，IL）。
结果
临床病理特点
例患者的临床病理特点见表1。AAH/AIS/MIA患者行系统性淋巴结清扫或取样检查均未发现淋巴结转移。
术中冰冻切片诊断的准确度
根据IASLC/ATS/ERS新修订肺腺癌亚型的分类标准，术中冰冻结果（FS）与最终病理结果（FP）有差异的病例有例，总体两者的一致率达84.4%。将AAH、AIS和MIA合并为低危组后，FS和FP的一致率高达95.9%。出现误差的病例多为对AIS和MIA的错分（见表2）。AAH/AIS/MIA的误差病例共有92例，占总偏差的73.6%。23例浸润性腺癌被术中冰冻误诊为原位腺癌(AIS)或微浸润腺癌(MIA)，其中13例为伏壁样生长为主腺癌(LPA)（56.5%），9例为腺泡为主型腺癌（39.1%），1例为乳头状为主型腺癌（4.3%）。术中冰冻切片（FS）诊断为非典型腺瘤样增生(AAH)、原位腺癌(AIS)、微浸润腺癌(MIA)和浸润型腺癌的准确率见表3。
肿瘤大小和冰冻切片诊断的准确度
结节的大小是影响FS诊断准确度的重要因素，对于直径≤1cm和1cm的肿瘤，FS的诊断准确率分别为79.6%和90.8%。两组间差异有统计学意义。
术中冰冻切片的误差对临床治疗决策的影响
在FS误诊的例患者中，98例（78.4%）已经做了充分的手术切除，最终的石蜡切片诊断为原位腺癌(AIS)或微浸润腺癌(MIA)，因此对临床治疗没有实质上的影响。2例微浸润腺癌患者被术中冰冻切片误诊为浸润性腺癌，进行了补充性肺叶切除术。剩余的25例误诊患者（20%）最终病理结果是浸润性腺癌。其中15例已行补充性肺叶切除术，肿瘤平均直径为1.58cm。还有2例腺泡为主型腺癌患者的肿瘤大小≦1.2cm，行肺段切除术，均未发现淋巴结和血管受侵。剩下8例患者行楔形切除术，其中3例患者年龄大于75岁，3例进行二次辅助补充性肺叶切除术+纵膈淋巴结清扫术，1例伏壁样生长为主腺癌行楔形切除术+淋巴结清扫术，包括纵膈和10站的淋巴结区域，术中冰冻未见阳性淋巴结和血管受侵。最后1例患者也是伏壁样生长为主腺癌，肿瘤直径1.3cm，拒绝二次手术，要求定期随访。总体来看，除了误诊的15例患者行补充性肺叶切除术以及3例因为高龄只行亚肺叶切除术的患者外，只有7例患者因术中冰冻切片(FS)误差影响了临床治疗决策。这7例患者中2例行肺段切除，5例行楔形切除，均未对病灶行充分的手术切除。因此FS误差造成临床治疗决策有明显影响的概率为0.9%（7/）。
生存分析
对符合入组条件的例患者进行生存分析，其中45例原位腺癌(AIS)，58例微浸润腺癌(MIA)，例浸润性腺癌。44例AIS/MIA患者进行系统淋巴结清扫术或淋巴结取样均未发现淋巴结转移。中位随访时间为31.2个月。AIS/MIA患者5年的无复发生存率（RFS）明显优于浸润型腺癌（%vs74.1%P﹤0.01图2A）。然而两者患者5年的总生存并没有明显的统计学差异（%vs88.3%P﹥0.05图2B）。
讨论
对I期的非小细胞肺癌是否行亚肺叶切除术一直存在争议，淋巴结清扫不充分是其主要缺陷，特别是楔形切除术。我们的研究结果显示，临床I期的浸润性腺癌发生N1和N2淋巴结转移的概率分别是1.6%和5.4%，这也是亚肺叶切除术的局限所在。切缘是亚肺叶切除术需要考虑的重要因素，楔形切除术的理想切缘应是﹥2厘米或至少1厘米，减少局部复发。然而楔形切除术的切缘常常小于1cm（48%~61%），即使是肺段切除术，23%~27%存在切缘小于1cm22，23。切缘不足直接导致局部高复发风险，这也是亚肺叶切除术失败的主要原因。而且肺部磨玻璃样变（GGO）在临床会有稳定无变化期24，局限切除术后的5年的随访时间对这类患者是不够的。因此需要慎重选择适应人群。我们的研究数据显示，AIS/MIA患者无论采取何种术式，其5年的无复发生存率（RFS）都是%，因此亚肺叶切除术是这类患者的最佳术式，确定为AIS/MIA的患者应行亚肺叶切除术。但对于浸润性腺癌的患者须进行肺叶切除术，亚肺叶切除并不适合。还需要进一步的研究阐述清楚。
本研究按照IASLC/ATS/ERS新修订标准分类，FS和FP诊断的一致率总体达84.4%。这个结果是非常令人满意的，因为有93.6%的肺部包块是小于等于2cm的。很少有研究按照IASLC/ATS/ERS的新分类标准分析FS对肺部包块诊断的准确性到底如何26，27。Walts和Marchevsky学者按照IASLC/ATS/ERS的新标准，重新分类并比较术中冰冻切片(FS)结果和最终病理(FP)结果的差异，结果显示浸润性腺癌的冰冻切片准确率为97%，然而原位腺癌(AIS)的准确率仅为59%，微浸润腺癌(MIA)的准确率只有46%。FS最常见的误差就是把微浸润腺癌(MIA)过度诊断为浸润性腺癌。Yeh等学者27应用术中冰冻切片诊断I期肺腺癌的组织学类型，微浸润腺癌(MIA)的准确率仅为41.3%，剩下一半比例患者都过度诊断为浸润性腺癌，但微浸润腺癌(MIA)的病例数太少（n=15）。我们的研究显示，应用术中冰冻切片诊断原位腺癌(AIS)的准确9率为73.8%，微浸润腺癌(MIA)的准确率为75.5%。FS主要误差是对AIS和MIA的错分。在Walts和Marchevsk26以及Yeh等学者27的两个研究中，AIS/MIA的病例数总体相对较少，这可能是他们没有得到FS诊断准确率高的原因之一。我们的研究中，病理科医生术中随即对冰冻切片做出诊断，这会让他们对诊断结果更加保守。而且术中冰冻切片的肺泡经常塌陷，这会对浸润程度的评估增加难度。诊断结果的保守是为了得到更高的FS诊断准确率。还可以通过弹性应变和膨胀技术等方法提高FS的诊断准确率。
肿瘤的大小是影响FS诊断准确性的重要因素，体积越大，准确性越高，这在其他学者的研究中也得以证实。Walts和Marchevsky回顾分析例肺部包块的术中冰冻切片结果，发现当包块直径大于1cm，FS的诊断准确性大幅提升。取样的误差也是主要原因，通常是取肿瘤组织的一个切面做术中冰冻，小病灶的一个切面不能完整准确代表病变的全部病理类型，一些微小的组织成分很容易被忽略。仅靠一个切面的术中切片很难准确评估肿瘤的侵袭能力，尤其当病灶较小，肿瘤组织还存在异质性。当肿瘤直径大于2cm时，多数都是浸润性腺癌。我们的研究结果也印证了这一说法。当肿瘤直径在2~3cm时，FS和FP诊断准确的一致性高达95.9%。Walts和Marchevsky的研究显示，FS诊断浸润性腺癌的准确率高达97%。我们的研究支持术中冰冻的一张切片可以用于评估肿瘤的侵袭能力。增加小病灶肿瘤的取样量也可提升FS的诊断准确性。
新分类标准要求检测小病灶的所有石蜡切片。但术中冰冻切片除了对良恶定性外，还要对肿瘤病变程度定量，如微浸润，浸润性等，来指导手术术式。而且术中冰冻的一个切片对肺癌最终病理(FP)结果的影响是微乎其微的。从理论上讲，在冰冻组织石蜡包埋过程会出现细胞膜和其他结构的破坏，抗原免疫反应随之变化。但是随着组织处理技术的改进，冰冻组织的分化特征和侵袭能力等特征的诊断已经可以与非冰冻组织相媲美。我们需要更多的
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