NatGen个胰岛单细胞

撰文：huacishu

IF=27.

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亮点：

1、研究使用组合条形码snATAC-seq分析了个胰岛细胞，并确定了12个簇，包括多种α、β和δ细胞状态。

2、研究对个可访问的染色质位点进行了分类，并确定了谱系和状态特异性调控的转录因子。

3、研究观察到空腹血糖和2型糖尿病的状态特异性富集，β细胞的全基因组关联研究和其他内分泌细胞类型的富集。KCNQ1基因座的2型糖尿病致病变异体rs预测了β细胞增强子与胰岛素的协同作用以及胚胎干细胞衍生β细胞的基因组编辑对胰岛素水平的影响。

加州大学圣路易斯分校助理教授KyleJ.Gaulton团队在国际知名期刊NatureGenetics在线发表题为“Single-cellchromatinaccessibilityidentifiespancreaticisletcelltype–andstate-specificregulatoryprogramsofdiabetesrisk”的研究论文。基因调控程序在很大程度上是由顺式调控元件协调的，顺式调控元件根据特定的线索指导基因的表达。与复杂疾病相关的基因变异在假定的顺式调控元件中高度富集。调控元件的活性通常局限于特定的细胞类型或细胞状态，限制了易接近的转座酶核染色质分析（assayfortransposase-accessiblechromatin，ATAC-seq）和其他表观基因技术在疾病相关组织中绘制单个细胞类型调控元件的能力。为了克服这一限制，从单个细胞核获得ATAC-seq图谱的新方法允许将异质样本中的染色质分解成组分细胞类型和亚型。这些进展为剖析疾病遗传风险的分子机制创造了机会。然而，迄今为止，来自疾病相关人体组织的易接近的转座酶染色质单核测序分析（Single-nucleusassayfortransposase-accessiblechromatinusingsequencing，snATAC-seq）数据是有限的。在这项研究中，作者利用snATAC-seq绘制了单个胰岛细胞的染色质图谱，定义了胰岛细胞类型和细胞状态的调控程序，描述了它们与2型糖尿病(type2diabetes，T2D)风险和空腹血糖的关系，并预测了2型糖尿病风险变体的分子机制。

为了获得高质量的单细胞图谱，研究首先过滤了读取次数少于次的条形码，结果在3个样本中总共有个细胞。然后，对以前的方法进行关键性的修改，并将这些细胞中可获得的染色质图谱进行聚类。在剔除了不合指标的细胞后，一共保留了个细胞，这些细胞被映射到12个细胞簇中。为了确定每个簇所代表的细胞类型，作者检测了内分泌细胞同源激素基因启动子区域和非内分泌细胞类型的已知标记基因的染色质可接近性。结果鉴定了代表β（INS-IGF2/胰岛素）、α（GCG/胰高血糖素）、δ（SST/生长抑素）、γ（PPY/胰多肽）、导管（CFTR）、腺泡（REG1A）、免疫（NCF2）、星状细胞（PDGFRB）和内皮细胞（CD93）的细胞簇。研究通过鉴定每个细胞簇最具特异性的启动子，为每个簇定义了一组更广泛的标记基因。结果观察到snATAC-seq中定义细胞类型的标记基因与胰岛单细胞RNA测序（single-cellRNAsequencing，scRNA-seq）之间高度的特异性相关。接着又使用chromVAR从JASPAR数据库中鉴定转录因子基序，这些基序富集在每个细胞的易接近的染色质中。对每种细胞类型中平均的基序富集进行分析，揭示了细胞类型特异的基序富集模式。例如，结果观察到PDX1在β和δ细胞中富集，MAF在α和β细胞中富集，IRF在免疫细胞39中富集，ETS在内皮细胞中富集。基于基序富集的细胞类型层次聚类显示β和δ细胞的调控程序与α和γ细胞密切相关，这与单细胞表达数据一致。相对于β细胞，在δ细胞染色质中高度富集的基序包括SCRT和ELF转录因子；相对于α细胞，在γ细胞染色质中富集的基序包括HOX和IRF转录因子。（图1）。

单细胞方法的一个主要优点是能够揭示细胞类型内的异质性。事实上，研究最初的聚类显示α，β和δ细胞分离成亚群。值得注意的是，胰岛素在β细胞亚群之间具有最易变的启动子可接近性；因此，作者分别将β细胞亚群更名为高胰岛素亚群和低胰岛素亚群。类似地，GCG启动子易接近性在α细胞亚群之间是可变的，作者将其重命名为GCGhigh和GCGlowα细胞；SST启动子易接近性在δ细胞亚群之间是可变的，我们将其重命名为ssghigh和SSTlowδ细胞。通过基因集富集分析（genesetenrichmentanalysis，GSEA），结果发现在区分高激素和低激素的α、β和δ细胞的基因上有明显的重叠。高激素状态下启动子易接近性增加的基因在激素分泌和葡萄糖反应中富集；相反，低激素状态下启动子易接近性增加的基因在应激诱导的信号反应中富集。结果还观察到区分不同的状态富集的转录因子基序。这些数据揭示了激素相关基因间内分泌细胞状态的表观基因差异产生和应激诱导的信号反应，并指出调节网络中的一个潜在共性，它可以控制内分泌细胞类型的特定状态功能。（图2）。

影响糖尿病和空腹血糖水平的基因变异富含胰岛调节元件。研究首先使用分层连锁不平衡（linkagedisequilibrium，LD）回归法评分确定了每种细胞类型和状态下易接近性染色质位点的变异体富集情况。结果观察到高胰岛素β细胞的空腹血糖水平显著升高，高胰岛素β细胞和低胰岛素β细胞状态的2型糖尿病相关性显著升高。结果还观察到更多的证据表明2型糖尿病与α细胞和δ细胞状态以及内分泌细胞的多种血糖特征有关。为了进一步解决遗传关联富集的异质性，研究检测了2型糖尿病和空腹血糖的富集以及单细胞图谱中的几个阴性对照性状。结果观察到空腹血糖变异的β细胞之间存在明显的异质性，其中高胰岛素细胞具有明显更强的富集。由于影响空腹血糖的许多变体也影响2型糖尿病，作者又将与空腹血糖相关的2型糖尿病基因座分组，并使用fGWAS64检测这些基因座对高胰岛素和低胰岛素β细胞位点的富集。结果观察到2型糖尿病/空腹血糖基因座仅对高胰岛素β细胞富集，表明影响血糖水平的2型糖尿病基因座具有状态特异性效应。为了了解这些细胞状态在2型糖尿病风险中的潜在作用，研究使用fGWAS对已知的2型糖尿病风险位点进行了富集分析。在DIAMANTE研究的2型糖尿病精细定位位点上检测了α、δ和γ位点，这些位点与β细胞位点不重叠。并且，结果还观察到2型糖尿病与GCGlowα细胞以及SSTlow和SSTlowδ细胞的富集。为了进一步支持这些细胞类型在2型糖尿病中的可能作用，一些精细定位的风险变体与这些细胞类型的特异性位点重叠，例如，在HHEX基因座的δ细胞特异性位点上定位的rs:CT（PPA=0.16）。在所有个细胞中，结果观察到空腹血糖与2型糖尿病富集和β细胞转录因子（如PDX）基序之间的正相关。进一步确定转录因子基序是否优先直接包含相关变体。对于空腹血糖，结果发现高胰岛素状态特异性转录因子基序的富集最强，最显著的是RFX和NEUROD。这些结果共同提供了β细胞及其转录因子在2型糖尿病风险和空腹血糖水平中的作用的状态解析，并暗示了其他内分泌细胞类型在2型糖尿病风险中的作用。（图3）。

为了验证作者的预测捕捉到了胰岛染色质易接近性的真实等位基因效应，研究首先将α和β细胞预测与染色质易接近性等位基因效应的直接测量进行了比较。结果发现所有α和β细胞状态的等位基因效应预测值和等位基因不平衡估计值之间存在显著相关性。在MIN6β细胞系中通过基因报告分析进一步验证了五种可能影响β细胞染色质的致病性2型糖尿病变体，它们对增强子活性具有一致的影响。研究还比较了对胰岛染色质易接近性数量性状基因座（caQTLs）的预测，并观察到在α或β细胞中具有预测效应的变体中caQTLs的显著富集。当基于共享效应、细胞类型或状态特异性效应对预测进行细分时，观察到只有在共享效应变异体中CAQTL显著富集。研究进一步分析预测了对胰岛染色质具有细胞类型和状态依赖性影响的遗传变异。具有状态特异性效应的变体倾向于破坏转录因子家族的基序，如高激素状态的NEUROD和RFX。当考虑到每种细胞类型时，结果观察到在β细胞和δ细胞中，甚至在亚基因组范围内显著的P值，都有2型糖尿病关联的富集。例如，在IGF2BP3位点，rs:CG（MAF=0.02）对β细胞染色质具有等位基因效应，精细定位支持可能在2型糖尿病（PPA=0.33）中起到因果作用。这些结果表明，细胞类型特异性染色质可以提供较低频率变异的准确功能预测。（图4）

为了校准共接近性在多大程度上反映调控元件之间的物理相互作用，研究在原发性胰岛中进行了按共接近性阈值分层的共接近性位点和从Hi-C和启动子捕获Hi-C（promotercaptureHi-C，pcHi-C）鉴定的染色质环之间的距离匹配比较。结果观察到胰岛染色质环的共接近性得分0.05的位点与非共接近性点相比有很强的富集。在共接近性的位点中，α、β和δ远端位点与基因启动子共接近性；大多数（71.9%）为细胞类型特异性位点。例如，pdx1启动子与β细胞中的31个位点和δ细胞中的39个位点共可访问，包括与胰岛pcHi-C直接一致的位点，其中只有7个位于α细胞中。尽管在β细胞中观察到rs和INS启动子之间的物理相似性，但是缺乏标准染色质环需要进一步验证。因此，在三个双等位基因克隆（KCNQ1?Enh）中通过CRISPR–Cas9介导的基因组编辑删除了人类胚胎干细胞中位于位点两侧的2.6kb区域，并使用已建立方案的修改版本将KCNQ1?Enh克隆和未编辑的对照克隆分化为β细胞。结果测定了增强子缺失对增强子2Mb范围内所有基因表达的影响，并观察到与对照细胞相比，KCNQ1?Enh中胰岛素的表达显著降低，而其他基因则没有。通过免疫荧光染色、流式细胞术和ELISA分析INS蛋白水平进一步显示KCNQ1?Enhβ细胞中胰岛素蛋白丰度降低，并且观察到等位基因间胰岛素表达存在显著差异，并有证据表明CDKN1C表达存在差异，尽管这并不显著。流式细胞术和ELISA分析胰岛素蛋白水平显示，不同等位基因间胰岛素丰度存在显著差异。（图5）

总之，研究详细描述了胰岛细胞类型和状态调控程序。当与基因精细定位和全基因组测序以及胰岛细胞类型特异性数据相结合时，这一资源将极大地加强对2型糖尿病风险分子机制的研究。该研究为利用疾病相关组织中的单细胞染色质来解释复杂疾病的遗传机制提供了一个很好的方法。

教授介绍

KyleJ.Gaulton?博士是加州大学圣路易斯分校儿科助理教授，主要研究遗传风险如何导致糖尿病的发展。利用计算和分子遗传学，Gaulton?博士实验室解决了人类基因变异及其对基因组功能和糖尿病风险的影响等问题。他的研究将有助于确定在1型糖尿病患者中保存β细胞的新策略。其研究成果多次发表于Nature，NatCommun，ProcNatlAcadSciUSA等国际著名期刊上。

参考文献

ChiouJ,ZengC,ChengZ,etal.Single-cellchromatinaccessibilityidentifiespancreaticisletcelltype-andstate-specificregulatoryprogramsofdiabetesrisk.NatGenet.;10./s---0.doi:10./s---0

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